Kötü bir sequence alignment iyi bir filogenetik ağaç üretebilir mi?

Bu yazıda neler var?

• Alignment sütunlarının phylogenetic analizde neyi temsil ettiği
• Conserved ve ambiguous regions arasındaki fark
• Gap-rich bölgelerin neden otomatik olarak “kötü” olmadığı
• Trimming/masking’in neden sihirli çözüm olmadığı
• Tree inference’tan önce uygulanabilecek input-quality kontrolleri
• Model seçiminin alignment’dan sonra neden hâlâ önemli olduğu

Alignment neden gereklidir?

Bir multiple sequence alignment’da amaç yalnız dizileri aynı uzunluğa getirmek değildir.

Temel amaç, mümkün olduğunca:

aynı ancestral character’dan türediği düşünülen pozisyonları

karşılaştırılabilir sütunlarda temsil etmektir.

Phylogenetic analysis bu sütunlardaki character states üzerinden çalışır.

Örneğin bir nucleotide column:

A
A
G
G

şeklindeyse bu pattern tree topology ve substitution model altında belirli evolutionary histories için bilgi taşıyabilir.

Ama aslında birbirine karşılık gelmeyen sequence positions aynı kolona zorlanmışsa model yanlış character correspondence üzerinde hesap yapacaktır.

NCBI evolutionary genomics kaynakları da doğru alignment’ın homologous residues’i karşılaştırmaya çalıştığını ve nonhomologous sequence correspondence’ın yanıltıcı olabileceğini vurgular.

Conserved region neden daha kolay hizalanır?

Yüksek sequence conservation bulunan bölgelerde residue correspondence çoğu zaman daha açıktır.

Örneğin tüm proteinlerde:

GKT

motifi çevresindeki sequence oldukça korunmuşsa alignment software’i bu bölgeyi daha tutarlı biçimde hizalayabilir.

Buna karşılık:

• hızlı evolving regions,
• uzun insertions/deletions,
• repetitive segments,
• çok düşük similarity

alignment uncertainty’yi artırabilir.

Systematic Biology değerlendirmeleri, alignment algorithms’in özellikle conserved regions’de güçlü olduğunu; çok sayıda insertion/deletion taşıyan bölgelerde positional accuracy’nin daha problemli olabildiğini göstermektedir.

Gap görünce bölgeyi silmeli misiniz?

Hayır.

Gap her zaman hata değildir.

Gerçek insertion/deletion events evolutionary information taşıyabilir.

Bir region’da gap bulunması onu otomatik olarak phylogenetically useless yapmaz.

Asıl soru:

bu region’daki positional correspondence güvenilir mi?

olmalıdır.

Örneğin bütün sequences’de açık biçimde tanımlanabilen bir üç-amino-acid insertion biyolojik olarak anlamlı olabilir.

Buna karşılık onlarca sequence boyunca:

• sürekli değişen gap konumları,
• çok düşük similarity,
• birbiriyle uyumsuz local alignment

bulunan bir region daha yüksek uncertainty taşıyabilir.

Bu yüzden:

gap-rich ≠ automatically delete

ve:

gap-free ≠ automatically reliable

ayrımlarını korumak gerekir.

“Daha fazla alignment column = daha fazla bilgi” doğru mu?

Her zaman değil.

Phylogenetic information yalnız column sayısına değil:

• variation pattern’ına,
• positional reliability’ye,
• model fit’e

de bağlıdır.

Binlerce belirsiz column eklemek, yüz güvenilir informative site’tan daha iyi inference sağlamayabilir.

Hatta systematic misalignment güçlü fakat yanlış phylogenetic signal üretebilir. Alignment-masking literatürü yanlış positional homology’nin downstream inference’ı bozabileceğini bu nedenle inceler.

O zaman ambiguous region’ları trim etmek her zaman iyi midir?

Hayır.

Bu da diğer uçtaki basitleştirmedir.

Alignment masking veya trimming:

• açıkça güvenilmez region’ların etkisini azaltabilir,
• fakat aynı zamanda gerçek phylogenetic signal da silebilir.

Systematic Biology’de yapılan geniş karşılaştırmalar, yaygın automated filtering yöntemlerinin bazı single-gene dataset’lerde phylogenetic inference’ı iyileştirmek yerine kötüleştirebildiğini göstermiştir.

Dolayısıyla:

untrimmed = kötü

ve:

trimmed = iyi

gibi evrensel bir denklem yoktur.

Trimming bir analitik karardır.

Alignment software yaptıysa neden hâlâ kontrol etmeliyim?

Çünkü alignment algorithm de:

• scoring parameters,
• gap penalties,
• guide tree,
• iterative strategy

gibi metodolojik kararlar kullanır.

Aynı sequence seti farklı alignment algorithms veya parameter choices ile birebir aynı MSA’yı üretmeyebilir.

Bu özellikle divergent sequences’de önemlidir.

Alignment sonuçlarını kontrol etmek:

software’e güvenmemek değil,

algorithmic output’un biological plausibility’sini değerlendirmek

demektir.

Alignment’dan sonra model neden geliyor?

İyi alignment da tek başına iyi phylogeny garantisi değildir.

Maximum-likelihood methods alignment sütunlarındaki değişimleri bir substitution model altında değerlendirir.

Model:

• transition/transversion davranışı,
• base/amino-acid frequencies,
• among-site rate variation

gibi assumptions taşıyabilir.

PhyML maximum-likelihood tree estimation yaparken bu model katmanını kullanır.

Bu yüzden workflow:

sequences → alignment → model → tree inference → support

şeklindedir.

Tree yalnız algorithm output’u değildir.

Input representation ve evolutionary assumptions’ın birleşimidir.

More sequences automatically better tree mı?

Daha fazla taxon sampling birçok durumda phylogenetic inference’a önemli katkı sağlayabilir.

Ama yalnız sequence sayısını artırmak kalite garantisi değildir.

Yeni sequence’ler:

• yanlış homolog/paralog seçilmişse,
• çok kısa coverage taşıyorsa,
• alignment uncertainty’yi aşırı artırıyorsa,
• annotation hatalıysa

yeni sorunlar getirebilir.

Doğru soru:

“Kaç sequence’im var?”

değil,

“Hangi evolutionary question için hangi sequence’leri karşılaştırıyorum?”

olmalıdır.

Ağaçtan önce neleri kontrol edebilirsiniz?

1. Sequence set’i

Aynı gene/domain/family context gerçekten karşılaştırılabilir mi?

2. Coverage

Bazı sequences diğerlerinin yalnız küçük bir region’ını mı kapsıyor?

3. Conserved blocks

Biyolojik olarak beklenen conserved motifs/domain regions mantıklı hizalanmış mı?

4. Ambiguous regions

Yoğun indel ve düşük similarity taşıyan alanlar var mı?

5. Gap pattern

Gapler interpretable events mi, yoksa alignment instability sinyali mi?

6. Alignment length

Analize gerçekte ne kadar güvenilir character bilgisi giriyor?

7. Trimming/masking kararı

Neyi neden çıkardığınız açık mı?

8. Model

Tree inference hangi substitution assumptions altında yapılacak?

Bu ne anlama geliyor?

Bir ağaç beklenmedik çıktıysa yalnız:

“PhyML yanlış ağaç verdi.”

diye başlamayın.

Geri dönüp şunları da sorun:

Sequence set doğru mu?

Alignment hangi region’larda belirsiz?

Yanlış paralog ekledim mi?

Coverage uyumsuzluğu var mı?

Trimming neyi değiştirdi?

Substitution model uygun mu?

Çünkü tree-building algoritması upstream kararları yeniden yazmaz.

Elindeki character representation üzerinden inference yapar.